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植物组培培养基本操作步骤

  组织培养的步骤

  培养基配制

  配制培养基有两种方法可以选择,一是购买培养基中所有化学药品,按照需要自己配制;二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂,如MS、B5等。自己配制可以节约费用,但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题,给实验带来麻烦。目前国内的情况看,多数还是自己配制。

  1、配制几种母液

  一般配制成100倍MS有机母液。配成1L母液,倒入1L试剂瓶中,存放于冰箱中。

  1.1配制MS大量元素母液

  1.2配制MS微量元素母液

  1.3配制MS有机母液

  1.4配制MS铁盐母液

  MS母液有5种大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液,共8种母液。

  2、激素母液的配制

  各种生长素和细胞分裂素要单独配制,不能混合在一起,生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解,细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解,然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

  3、配制培养基

  以配置1L MS培养基为例,按顺序进行如下操作:

  3.1先在烧杯中放入一些蒸馏水。

  3.2分别取上面八种母液10ml倒入。

  3.3一般称取30g蔗糖倒入,搅拌溶解。

  3.4加蒸馏水用量筒定溶至1L。

  3.5按设计好的方案添加各种激素,由于激素的用量很小,而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话好用微量可调移液器吸取,减少误差。

  3.6用精密试纸或酸度计调整PH至5.7~5.8。(有条件的话使用酸度计,比较精确) 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

  1当量HCL配制:用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

  1当量NaOH配制:称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

  3.7称取5g左右琼脂粉(质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在电炉上加热至沸腾,直到琼脂粉熔化。

  3.8稍微冷却后,分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口,用橡皮筋或绳子扎紧。

  3.9放入消毒灭菌锅灭菌,灭菌20分钟左右。

  3.10灭菌后从灭菌锅中取出培养基,平放在实验台上令其冷却凝固。

  灭菌

  灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。依此观点,无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

  这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。

  无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体,高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。

  灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种、超净台等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作。

  植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚至超过微生物的培养要求,这是因为培养基含有丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的,必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌,才能保证培养时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。

  常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

  1.培养基用湿热灭菌

  培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

  注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时,开始计时,维持压力0.1~0.15MPa,20分钟。

  按容器大小不同,保压时间有所不同。如果容器体积较大,但是放置的东西数量很少,也可以减少时间。
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