甘薯（Ipomoea batatas）又名山芋、红芋、番薯、红薯、地瓜，为旋花科甘薯属一年生或多年生蔓性草本植物，富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素及多种矿物质，有“长寿食品”之誉，是重要的粮食、饲料和工业原料用作物，在世界粮食生产中总产排列第七位。目前我国的甘薯种植面积为600多万hm2，年产鲜薯1亿多吨,均居世界首位。甘薯耐旱、耐瘠薄，生物产量高，除食用外，还是重要的可再生能源原料之一，在保障国家粮食安全和能源安全方面的作用将日益突显。但近几年来，我国甘薯的种植面积增长比较缓慢，制约甘薯生产面积增长的主要问题是种性退化，而引起甘薯种性退化的原因主要是病毒侵染。甘薯是无性繁殖作物，主要通过蔓秧、种薯和苗繁殖，病毒易在体内积累，从而逐年加重，造成减产，我国每年因病毒病减产造成损失达40多亿。当前防治甘薯病毒病一般采用剥离茎尖分生组织，离体培养后得到脱毒苗来去除病毒，培育、繁殖和应用脱毒种薯。脱去病毒后的甘薯苗恢复了种性，生长势增强，产量提高，品质变，增产效果为明显，增产幅度可达80％以上，在生产上有着较好的应用前景。

　　本实验选取我所推广的淀粉型甘薯品种—徐薯22作为供试品种，针对甘薯茎尖分生组织培养和扩繁中培养基配方、糖用量等方面进行了研究，以期提高茎尖培养成活率和成苗率，为脱毒苗工厂化生产提供技术支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 供试材料

　　于每年2月初挑选表皮光滑、正常薯形、大小均匀、无病虫害和无损伤薯块，放置在25～30℃的温室内进行催芽，一周后块茎上的芽开始萌发。

　　1.2 取材与消毒

　　当块茎上的芽丛长到10cm时，切下顶部约3cm长的芽段，剪去已展开的叶片，放入烧杯中，放入0.1％洗衣粉水中洗涤，流水冲洗20min，再用纱布吸干水分，置于超净工作台上。在无菌操作台内采用3种不同配比的消毒液进行消毒，倒去消毒液后，用无菌水漂洗5～6次，漂洗后将芽段放在灭过菌的滤纸上吸干水分。不同配比消毒剂处理时间见表1。

　　1.3 茎尖培养

　　在超净工作台上剪取约1cm长的幼茎先端约，在40倍解剖镜下切除较大的叶原基，找到位于顶端的茎尖生长点（生长点呈透明扁平的突起），用解剖针切下生长点，长度约为0.2～0.3mm（一般带1～2个叶原基），切下后，用解剖针将茎尖挑到装有培养基的三角瓶中进行培养，每瓶接种一个外植体，每接种一个茎尖后都要将解剖针放在酒精灯上烧10s，以降低操作中带来的污染。培养基为添加了不同种类、浓度生长调节剂的Ms培养基，编号为1～9，另设不加任何生长调节剂的Ms培养基作为对照，每种培养基中附加30g/L蔗糖和6g/L琼脂，PH值5.8。培养基中植物生长调节剂配比见表2。培养条件为温度25℃、光照强度2000Lx、光照时间16h/d。培养50d后统计植株高度、叶片数、根数等生长情况。

　　1.4 病毒检测

　　当茎尖苗长到6～7片叶时就可进行病毒检测，检测方法有血清学检测、电镜检测和指示植物嫁接等，快捷的检测方法是电镜检测，可直接在电镜下观察到病毒质粒。去除检测出的带毒苗和品种特征改变或性状变差的茎尖苗，剩余的即为脱毒苗，可直接用于快繁生产。

　　1.5 脱毒苗组培快繁

　　利用茎尖分生组织培养获得脱毒苗后，要获得大量可供生产使用的种苗，快繁技术起着决定性的作用。脱毒苗快繁可以采用试管苗单叶节扦插来进行，即在无菌条件下，将茎尖苗剪切成段，每段带一节和一片叶，形态学下端扦插于加入生长调节剂的培养基中，通过生长调节剂的作用使茎段下端长出根，侧芽向上萌发形成一棵完整的植株。试验中设计了10种加入不同种类、浓度生长调节剂的培养基，以不加任何生长调节剂的Ms培养基做对照，筛选适宜的快繁培养基每处理10个重复，每瓶接入3个节段，快繁培养基不同生长调节剂配比见表3。培养条件为：温度28℃，光照强度2000Lx，光照时间16h/d，培养20d后统计植株高度、叶片数、生根数等生长情况；得出适宜的培养基配方后，设置五个处理来筛选培养基中的糖用量，每个处理30瓶，培养20天后统计株高、节间数和生根数等，结果见表4；

　　1.6 炼苗与移栽

　　甘薯脱毒苗在适宜的快繁培养基上一般30天后可长成为完整的植株，然后就可进行炼苗、移栽。炼苗时将装有小苗的培养瓶搬到15～20℃的培养室中放置5d，第6d打开培养瓶用镊子取出小苗，洗去根部残留的琼脂，再用0.1％的甲醛溶液浸泡10min，然后以5cm×5cm的株行距栽入带防虫网棚的培养床上，栽培基质可用蛭石、珍珠岩、粗沙、炉灰渣、谷壳、锯木屑等，移栽前一周进行消毒。小苗栽好后立即用喷壶喷水，再用1/800～1/1000百菌清或多菌灵喷淋，然后搭小拱棚并盖上遮阳网，每天浇水一次，成活率可达98％以上。

　　2 结果与分析

　　2.1 不同表面消毒方法对茎尖成活率和污染的影响

　　表1消毒方法的灭菌效果和对茎尖成活率的影响

　　序号 

　　表面消毒方法 接种数（个） 污染数

　　（个） 

　　污染率 

　　成活率

　　1 0.1％升汞溶液15min 60 5 8.33％ 71.8％

　　2 75％的酒精30s+2％的次氯酸钠溶液10 min 

　　60 

　　13 

　　21.67％ 

　　86.9％

　　3 75％的酒精30s+0.1％的升汞溶液10 min 

　　60 

　　3 

　　5.0％ 

　　83.4％

　　从试验结果来看，升汞的灭菌效果比次氯酸钠好，酒精和升汞结合起来灭菌可达到较好的效果，有效地控制污染率，但升汞渗透性强，容易损伤茎尖组织，在漂洗时需多清洗2-3次，否则影响成活率。综合不同处理的灭菌和茎尖的成活率效果，处理3是佳灭菌选择。

　　2.2 不同茎尖培养基配方的效果

　　表2 不同生长调节剂培养基配比对茎尖组织生长的影响

　　处理 6-BA

　　(mg/L) NAA

　　(mg/L) GA3

　　(mg/L) 接种数(个) 成苗数(个) 成苗率 茎尖苗生长情况

　　ck 0 0 0 30 2 6.67％ 茎尖生长缓慢，90天后成苗

　　1 0.5 0.1 0 30 8 26.67％ 茎尖淡黄色，开始大小无明显变化

　　2 0.5 0.2 0 30 12 40.0％ 茎尖逐渐转为绿色，开始生长

　　3 0.5 0.3 0 30 4 13.33％ 茎尖淡黄色，大小无明显变化

　　4 1.0 0.1 0 30 7 23.33％ 茎尖基部产生愈伤组织

　　5 1.0 0.2 0 30 10 33.33％ 茎尖基部产生愈伤组织

　　6 1.0 0.3 0 30 5 16.67％ 茎尖基部产生愈伤组织

　　7 0 0 0.25 30 6 20.0％ 茎尖变为绿色，开始大小无明显变化

　　8 0.5 0.2 0.25 30 14 46.67％ 茎尖绿色，30天后开始生长

　　9 2.0 0.2 0 30 4 13.37％ 产生大量的愈伤组织，苗细弱,叶片小，叶色浅绿

　　试验结果显示，茎尖分生组织在不含生长调节剂的培养基中生长缓慢，成苗率低，成苗时间长。但在培养基中加入6-BA、NAA后成苗率有了很大的提高，低浓度的6-BA可促进茎尖分生组织分化出芽和根，高浓度的6-BA则会使茎尖长出愈伤组织，影响成苗率；GA3能起到促使芽伸长的作用，在培养基中加入GA3后，可缩短成苗时间，50天就可长成茎尖苗。

　　2.3 病毒唑对茎尖苗脱毒率的影响

　　病毒唑是一种核苷结构的类似物，加入培养基中对病毒有抑制作用。实验发现，在培养基中加入10mg/L的病毒唑后，脱毒率可达到75.0％。

　　2.4 不同生长调节剂配比对甘薯脱毒苗快繁的影响

　　表3不同生长调节剂对脱毒苗快繁的影响

　　处理 6-BA（mg/L） NAA

　　(mg/L) 株高

　　（cm） 叶片数

　　(片) 生根数

　　（cm） 小苗生长情况

　　1 0 0 1.95 4.26 3.5 生长正常

　　2 0 0.1 6.49 7.32 5.4 生长正常

　　3 0 0.2 7.86 8.55 6.41 生长正常

　　4 0 0.3 6.38 7.32 6.76 生长正常

　　5 0.2 0.1 3.67 6.85 5.34 茎节下端产生少量愈伤组织

　　6 0.2 0.2 3.17 5.67 4.84 茎节下端产生少量愈伤组织

　　7 0.2 0.3 3,83 4.51 3.58 茎节下端产生少量愈伤组织

　　8 0.5 0.1 3.93 3.74 3,28 茎节下端产生大块愈伤组织

　　9 0.5 0.2 2.71 5.16 2.15 茎节下端产生大块愈伤组织

　　10 0.5 0.3 1.12 2.18 2.23 茎节下端产生大块愈伤组织

　　从上表可看出，在组培快繁阶段培养基中并不需要加入6-BA,诱导生根起主要作用的生长调节剂是NAA。加入6-BA会使茎段下端产生愈伤组织，生根数减少，侧芽萌发后节间缩短，叶形变小，生长缓慢，炼苗时成活率低；而低浓度的NAA能促进脱毒苗生根，但浓度较高反而起到抑制作用，如NAA的浓度为0.3mg/L时，脱毒苗刚开始生长迅速，快繁2～3代后却出现叶片发黄，生长停止的现象。此外，在培养基中增加少量的泛酸钙（2mg/L）可促使脱毒苗生长迅速，叶片增多，20天后就可进行一次快繁，从而提高繁殖系数。

　　2.5 培养基中不同糖用量对脱毒苗生长的影响

　　培养基中的糖是试管苗生长所必不可少的碳源和能源，同时还具有调节渗透压的作用。生产中为了节约成本，可用食用糖代替蔗糖。但不同的糖用量却对繁殖系数有影响，结果见下表。

　　表4不同糖用量对脱毒苗生长的影响

　　培养基中的糖浓度(mg/L) 节间数(个) 株高（cm） 根长(cm)

　　0 1.0 1.51  1.06

　　20 7.4 5.08 11.74

　　30 9.5 6.24 22.38

　　50 9.7 6.37 23.67

　　80 10.2 6.45 24.49

　　试验结果显示，培养基中不加入蔗糖时植株没有生长，随着糖用量从0增加30g/L，节间数也从1.0增加到9.5个；但当糖用量超过30g/L时，糖用量再增加，节间数增加却并不显着，根的长度增加也较小，并且从快繁的角度来说，对增殖系数影响大的是节间数，所以在甘薯快繁培养基中糖用量为30g/L较为适宜。

　　2.6 适宜的培养条件：

　　甘薯为喜温作物，培养温度在20℃以下时，脱毒苗生长较为缓慢，下部叶片变黄，温度在28～30℃时，植株生长较快，节间适中，叶片较大；而温度超过30℃时则脱毒苗生长反而下降，叶片增加较少；光照对脱毒苗的影响主要是影响其节间的长度，光照为1000lx时，脱毒苗的节间变长，叶片发黄，影响生长。经反复试验，光照强度在2000lx,光照时间16h/d时，脱毒苗生根时间短，节间适中，茎杆粗壮，15d就长到10～12cm。

　　3  小结与讨论：

　　茎尖分生组织培养是目前培养脱毒苗，生产脱毒种薯的主要途径。实验结果表明：①在茎尖的消毒中，75％酒精30秒结合0.1％的升汞浸泡10分钟可取得较好的灭菌效果，污染率仅为5.0％。②剥离的茎尖组织诱导成苗是脱毒快繁的技术关键，在培养基中加入少量的6-BA有促进根和芽的分化并伸长的效果，但浓度过高（超过1mg/L）时会使茎尖产生愈伤组织，反而不易分化成苗，适宜的浓度为0.5mg/L;而低浓度的GA3能促进芽伸长，与6-BA和NAA结合能提高出苗率，缩短出苗时间，因此茎尖培养阶段适宜的培养基配方为：MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/lNAA+0.25m g/LGA3+10mg/L病毒唑。③在培养基中加入病毒唑可有效地脱去病毒，增加茎尖苗的脱毒率，但加入病毒唑后会出现抑制茎尖的伸长，延长成苗时间，抑制的机理还有待进一步研究。④在脱毒苗快繁中，NAA是起主导作用的因素，不需要加入6-BA,加入6-BA会使茎段下端产生愈伤组织，生根数减少，叶片变小，茎杆较细，移栽时影响成活率；而0.1～0.2mg/L的NAA对甘薯茎段生根有促进作用，NAA超过0.3mg/L时则会抑制侧芽的伸长，并且培养一段时间后脱毒苗叶片变黄、干枯，停止生长，反而不利于快繁工作的开展，适宜的NAA浓度为0.1～0.2mg/L；培养基中适宜的糖浓度为30g/L。适宜的培养条件为：温度28-30℃、光照强度2000lx、光照时间16h/d。

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